来源:今日热点 | 2023-03-23 15:54:32 |
硫酸铵沉淀是一种纯化抗体的化学方法。先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。 边搅拌边慢慢加 SAS 到样品溶液中,使浓度为 0.5:1 (v/v) ; 将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时 或过夜( 4 ° C );3000 ′ g 离心 30 min ( 4 ° C ),保留上清液;上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ,再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨; 上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ,再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨;杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是非常有效。
硫酸铵沉淀的操作步骤是什么?
以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。
配制饱和硫酸铵溶液:
( SAS ) 1.将 767g ( NH 4 ) 2 SO 4 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液( 4.1 mol/L, 25 ° C ). 2.其它不同饱和度铵溶液的配制
沉淀:
1.样品(如腹水) 20 000 ′ g 离心 30 min ,除去细胞碎片;
2.保留上清液并测量体积;
3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中,终浓度为 1 : 1 ( 4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜( 4 ° C ),使蛋白质充分沉淀
透析:
1.蛋白质溶液 10 000 ′ g 离心 30 min ( 4 ° C )。弃上清保留沉淀;
2.将沉淀溶于少量( 10-20ml ) PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时( 4 ° C ),每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨;
3.透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。
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